Desarrollo y validación de técnicas analíticas para la determinación de biomarcadores sanguíneos en ensayos preclínicos. ¿Por qué y para qué? / Development and validation of analytical techniques for the determination of blood biomarkers in preclinical trials. Why and what for?

Resumen El descubrimiento de un nuevo principio activo farmacéutico implica estudios preclínicos, que tienen como objetivo demostrar que es eficaz y seguro para un posterior ensayo en seres humanos. Esto conduce a la necesidad de desarrollar tecnologías que aprovechen las nuevas herramientas analíticas disponi bles dentro de un contexto donde los resultados de las pruebas realizadas, estén plenamente documentados, bajo sistemas de buenas prácticas de laboratorio auditables. En esta revisión se actualizan y describen algunos de los ensayos realizados en la etapa preclínica del desarrollo de un nuevo fármaco y el estado actual de la tecnología analítica empleada para el dosaje de diferentes biomarcadores sanguíneos de interés. Se analizaron los biomarcadores más relevantes, las normativas de validación de las técnicas analíticas empleadas para su determinación y los problemas que se presentan al tratar de aplicarlas.

Abstract New drug discovery involves preclinical studies to demonstrate its effectivity and safety for further tests in humans. This leads to the need to develop technologies that take advantage of the new analytical tools available within a context where the results of the tests carried out are fully documented, under auditable systems of good laboratory practice. This review updates and describes some of the tests carried out in the preclinical stage of the development of a new drug and the current state of the analytical technology used to measure different blood biomarkers of interest. Biomarker parameters were analyzed at the physiological level, considering both the validation regulations of the analytical techniques used for their determination as the problems that arise when trying to apply them, since many of these biomarkers are endogenous compounds in the used matrices.

Cytoskeletal proteins in the follicular wall of normal andcystic ovaries of sows

The expression of cytoskeletal proteins was evaluated immunohistochemically in 36 normal ovaries sampled from 18 sows and 44 cystic ovaries sampled from of 22 sows, was evaluated. All sows had history of reproductive problems, such as infertility or subfertility. The immunohistochemically stained area (IHCSA) was quantified through image analysis to evaluate the expression of these proteins in the follicular wall of secondary, tertiary, and cystic follicles. Cytokeratins (CK) immunoreactivity was strong in the granulosa cell layer (GC) and mild in the theca interna (TI) and externa (TE) of the normal follicles. There was severe reduction of the reaction to CK in the GC in the cystic follicles, mainly in the luteinized cysts. The immunoreactivity for vimentin was higher in the GC from normal and cystic follicles in contrast with the other follicular structures. In the luteinized cysts, the IHCSA for vimentin was significantly higher in TI and in both observed cysts, the labeling was more accentuated in TE. Immunohistochemical detection of desmin and -SMA was restricted to the TE, without differences between the normal and cystic follicles. The results of the current study show that the development of ovarian cysts in sows is associated to changes in the expression of the cytoskeletal proteins CK and vimentin.

A expressão de proteínas do citoesqueleto foi avaliada por imuno-histoquímica em ovários normais e císticos de porcas matrizes. Amostras de 36 ovários normais (18 porcas) e de 44 císticos (22 porcas) foram avaliadas. Todas as matrizes apresentaram histórico de problemas reprodutivos, como infertilidade ou subfertilidade. As áreas coradas por imuno-histoquímica (IHCSA) foram quantificadas por avaliação de imagens avaliando a expressão dessas proteínas na parede folicular de folículos secundários, terciários e císticos. A imuno-reatividade para citoqueratina (CK) foi forte na camada de células da granulosa (GC) e discreta nas tecas interna (TI) e externa (TE) dos folículos normais. Houve redução acentuada da reação de CK na CG dos folículos císticos, principalmente nos cistos luteinizados. A reação para vimentina foi mais intensa na CG dos folículos normais e císticos em comparação com outras estruturas foliculares. Nos cistos luteinizados, a IHCSA para vimentina foi significativamente maior na TI e, em ambos os cistos observados, a marcação foi mais acentuada na TE. A marcação de desmina e actina alfa de músculo liso foi restrita a TE, sem diferenças entre os folículos normais e císticos. Os resultados do presente estudo mostram que o desenvolvimento de cistos ovarianos em porcas matrizes está associado a alterações na expressão das proteínas do citoesqueleto CK e vimentina.

Polycystic ovarian syndrome: temporal characterization of the induction and reversion process in an experimental model

Numerosos modelos experimentais têm sido desenvolvimos para o estudo da síndrome do ovário policístico em ratos. No presente estudo, a síndrome foi inducida por exposição à luz constante. O processo foi avaliado durante sua indução e inclusive durante sua reversão. O ciclo estral foi analisado através de citologia vaginal; parámetros reprodutivos foram avaliados por acasalamento, bem como a morfologia ovariana. Todos animais desenvolveram a síndrome depois de 13 semanas de luz permanente. As características histológicas dos ovários, na semana 15, foram similares àquelas observadas na síndrome do ovário policístico em humanos e outras espécies. Após a regressão da síndrome, não houve diferenta em nenhum dos parámetros reprodutivos avaliados, quando comparados com o grupo controle.

Histochemical study of the extracellular matrix components in the follicular wall of induced polycystic ovaries

Numerous models have been developed to study polycystic ovarian syndrome in rats. In the present study, the syndrome was induced by exposure to constant light. The histological structure and differential distribution of extracellular matrix (ECM) fibers as well as the glycosaminoglycans (GAGs) content and composition of the ovarian follicular wall of rats with polycystic syndrome were evaluated. Histochemical differences were observed in the graunlosa and theca externa of follicular cysts when compared to normal preovulatory follicles. The colagen content of the theca externa of follicular cysts, quantified by the picrosirius method, was higher than in the controls. The neural carbohydrate and acidic GAC levels were lower in the granulosa and higher in the theca externa of cyst follicles than in control ovaries. Histomorphometrically, the follicular diameter was both a convenient and appropriate measurement for describing the cyst status; there were no differences in the thickness of each follicular layer. In conclusion, differences in the components of ECM were observed in the follicular wall of ovarian cysts compared eith normal preovulatory follicles. Howere, sinde these changes did not occur uniformly in all layers of the follicular wall, their role in cyst development remains to be established.

Identificación de hongos en tejidos y cultivos: importancia de sustancias argirófilas en su estructura / Identification of fungi in tissues and cultures: the importance of argirophilic substances on its cellular walls

Se presenta un método basado en la combinación de la acción de microondas con uno de los métodos de impregnación argéntica de Del Río Hortega. Se estudiaron materiales de tejidos patológicos y cultivos de hongos. Además del análisis morfológico, se consideran las causas de la reducción de la plata iónica a metálica, algunas características del reactivo argéntico y su relación con la constitución histoquímica de las paredes celulares. Se destaca la rapidez en la demostración de los hongos, la definición satisfactoria de los tejidos afectados, las ventajas de trabajar con un reactivo estable, la omisión de sustancias carcinogenéticas, la posibilidad de impregnar estructuras fúngicas en preparados previamente teñidos con técnica anilínica y la extensión del método a materiales de cultivo sin necesidad de fijación formólica previa.